دارالفنون در روز یکشنبه ششم دی ماه ۱۲۳۰ برابر با پنجم ربیع‌الاول ۱۲۶۸، سیزده روز پیش از قتل امیرکبیر و با حضور ناصرالدین شاه، میرزا آقاخان نوری صدراعظم جدید و گروهی از دانشمندان و معلمین ایرانی و اروپایی با ۳۰ نفر شاگرد رسماً گشایش یافت. در روزنامه وقایع اتفاقیه آمده‌است: در روز یکشنبه پنجم ماه ربیع نخستین از سال ۱۲۶۸ هجری مطابق سنه خامسه از جلوس سعادت مأنوس، مدرسه مبارکه دارالفنون، واقعه در ارک محروسه تهران که بنا و انشاء از سال سابق شروع شده بود بر حسب امر فرمان مطاع افتتاح گردید و از آن تاریخ علوم مستظرف و فنون مستحدث و صنایع مستغرب که حکمای اروپا اساس آن‌ها را در ظرف چندین قرن برپا ساخته بودند در این تأسیس با تقدیس انتشار همی گرفت و اشتهار همی پذیرفت. در آن زمان هفت معلم اتریشی، آموزش محصلینی را که اغلب از خانواده‌های مهم و بانفوذ بودند، بر عهده داشتند. با وجود آغاز به کار مدرسه عملیات ساختمانی آن تا سال ۱۲۶۹ قمری ادامه داشت. در سال ۱۳۰۴ قمری نیرالملوک وزیر علوم تالار نمایشی در مدرسه ساخت تا مکانی برای اجرای تئاتر باشد. از آن زمان درِ اصلی مدرسه در خیابان همایون بسته و دری به خیابان ناصریه سابق و ناصر خسرو فعلی گشوده شد. بعدها با اعتراض سفیر انگلستان به ملیت اتریشی این افراد، چند استاد ایتالیایی، فرانسوی و آلمانی نیز به این افراد اضافه شدند. سه استاد ایرانی طب، عربی و جغرافیا و یک استاد فرانسوی مقیم ایران نیز به زودی به این جمع افزوده شدند.

میرزا تقی خان امیرکبیر محل ساختمان را خود شخصاً در مجاورت کاخ‌های سلطنتی و در مکانی که سربازان آموزش نظامی می‌دیدند با موافقت ناصرالدین شاه انتخاب کرد، و به میرزارضاخان مهندس تبریزی که یکی از پنج نفر محصل اعزامی به لندن در زمان عباس میرزا بود دستور تهیه نقشه ساختمان را داد. نقشه ساختمان با استفاده از طرح عمارت سربازخانه ولیچ انگلیس در اواخر سال ۱۲۲۹ آماده و محمدتقی معمارباشی به احداث آن مأمور شد و کار را آغاز کرد. قسمت شرقی بنا در سال ۱۲۳۰اتمام یافت. هشتاد سال پس از فعالیت و در سال ۱۳۰۸ (۱۳۴۸ قمری) ساختمان مدرسه به دستور اعتمادالدوله وزیر وقت معارف تخریب شد و ساختمان فعلی با نقشهٔ مهندسی روسی ساخته شد. ساختمان مدرسه پنجاه اتاق مربعی چهار در چهار ذرعی داشت که در چهار طرف حیاط قرار گرفته بودند. وضعیت ظاهری همه این اتاق‌ها «منقش و مذهب» توصیف شده که مشخص است همه آن‌ها دارای تزیینات چشم‌نواز نقاشی و گچبری رنگی بوده‌اند. جلو اتاق‌ها ایوان و سایبان ساخته بودند. در وسط حیاط مدرسه حوض بزرگی قرار داشت که در اطراف آن باغچه‌هایی برای کاشت درخت و ایجاد فضای سبز و گلکاری ایجاد شده بود. حد فاصل باغچه‌ها را خیابان کشی و با آجرهای بزرگ معروف به قزاقی فرش کرده بودند. در ضلع شرقی و در پشت کلاس‌ها چندین مغازه ساخته بودند که وزارت علوم و معارف در بالاخانه آن‌ها مستقر بود. در ضلع شمالی و پشت ساختمان مخابرات امروزی محوطه‌ای وسیع با چند اتاق کوچک و بزرگ قرار داشت که مخصوص دانشجویان شعبه نظامی و بعد از آن‌ها موزیک بود. دارالفنون مجهز به آزمایشگاه فیزیک و شیمی و داروسازی، چاپخانه، کتابخانه، سفره خانه یا غذاخوری بود. در یکی از اتاق‌های آن دو اسکلت برای آموزش دانشجویان پزشکی نگهداری می‌شد. در نیمه اول سال۱۳۰۴ قمری نیرالملوک وزیر علوم با همکاری امین السلطان وزیر مالیه با خرید و تخریب خانه‌های ساکنان ضلع جنوبی مدرسه، تالار بزرگ نمایش را ساخت تا ناصرالدین شاه، که در سفر فرنگ با تئاتر آشنا شده بود، در آن به تماشای تئاتر بپردازد. دراصلی مدرسه ابتدا به خیابان باب همایون باز می‌شد که بنا به مصالحی آن را بستند و در ورودی را به خیابان ناصریه یا ناصر خسرو فعلی باز کردند.

ساختمان دارالفنون زمان امیرکبیر هشتاد سال پابرجا ماند و با وجودی که همچنان قابل استفاده بود، در سال ۱۳۰۸ خورشیدی تخریب شد. در این سال میرزا یحیی خان اعتمادالدوله قراگزلو وزیر معارف وقت ساختمان اولیه را در هم کوبید و با نقشه و نظارت مارکف، مهندس روسی، ساختمان فعلی را به جای آن ساخت. علی اصغر حکمت وزیر فرهنگ وقت نیز در سال ۱۳۱۳ در شمال و جنوب، عمارتی را بر آن افزود. در حال حاضر درِ ورودی بنا در شمال شرقی مدرسه و رو به خیابان ناصر خسرو باز می‌شود. این دروازه به شیوه معماری سنتی دارای طاق زنجیره‌ای بلندی است. در دوسوی درگاه دو ستون استوانه‌ای نقره‌ای رنگ طاق این دروازه را نگه داشته‌است. درست بالای در دولنگه‌ای چوبی و قهوه‌ای رنگ مدرسه واژه دارالفنون و سال تأسیس آن ۱۲۶۸ قمری را بر کاشی نوشته‌اند. این در که در یکی از چهار کنج مدرسه قرار دارد به فضایی هشتی مانند باز می‌شود که از سوی دیگر به فضای حیاط راه دارد. ساختمان دو طبقه مدرسه در زمینی مستطیل شکل بنا شده‌است. در رأس هر چهار ضلع چهار پلکان مارپیچی طبقه پایین مدرسه را به طبقه بالا متصل می‌کند. درحاشیه بیرونی پله‌ها، نرده آهنی تو پری نصب شده‌است که مانع از سقوط افراد می‌شود. ساختمان کنونی سی و دو کلاس درس دارد: دوازده کلاس در دو طبقه ضلع شرقی و به همان اندازه در ضلع غربی و هشت کلاس در دو طبقه ضلع شمالی. سالن‌های نمایش و غذاخوری نیز در ضلع جنوبی ساخته شده‌اند. احتمالاً این دو سالن باید از همان بناهای اولیه دارالفنون باشد و مارکف ساختمان کلاس‌ها را تخریب و بازسازی کرده‌است.

داودخان مسیحی به عنوان نماینده میرزا تقی خان امیرکبیر به اتریش رفت تا به سفارش وی ۷ استاد در زمینه کارهای نظامی و امور وابسته به آن، استادی برای آموزش فیزیک، شیمی و داروسازی و دو معدن‌چی که در کار معدن توانمند باشند را به خدمت بگیرد. بدین ترتیب ۷ استاد به ایران دعوت و به عنوان اولین استادان دارالفنون مشغول به کار شدند. نام این هفت نفر عبارتند از: یاکوب ادوارد پولاک، معلم طب فوکتی، معلم طبیعیات و داروسازی چارنوتا، معلم معدن‌شناسی زاتی، معلم ریاضیات و هندسه موسیو کرشیش، معلم توپخانه آلفرد بارون دی گومنس، معلم پیاده‌نظام نمیرو، معلم سواره‌نظام اضافه بر این هفت نفر شخصی به نام موسیو ریشارد فرانسوی که فارسی را خوب می‌دانست و تقریباً ایرانی شده بود و میرزاملکم‌خان که از ارامنهٔ جلفا بود و مدتی سمت وزیر مختاری در انگلستان را به عهده داشت نیز برای تدریس در رشته‌های زبان فرانسه و جغرافیا برای دارالفنون استخدام شدند. معلمان اروپایی همه در رشته مربوط به خود افراد دانشمندی بودند و علاوه بر وظایف تدریسی به تألیف کتاب‌های درسی هم می‌پرداختند. بعدها معلمینی از ایتالیا، آلمان و فرانسه نیز استخدام شدند.

از آغاز تأسیس دارالفنون برخی از درباریان به مخالفت با آن پرداختند. اولین مخالف آن، جانشین امیرکبیر، میرزا آقاخان نوری بود که به دنبال انحلال آن برآمد. آقاخان درصدد برآمد تا معلمان اتریشی را به وطن خود بازگرداند و نماینده بریتانیا از اقدامات وی پشتیبانی کرد و حتی سرهنگ شیل به شاه توصیه کرد که مدرسه دارالفنون به ضرر سلطنت اوست. ناصرالدین شاه قاجار به این حرف‌ها اعتنا نکرد و به حمایت و حفظ دارالفنون پرداخت. با این حال علی‌رغم حمایت‌های اولیه شاه از دارالفنون، کم‌کم وی نسبت به آن بدبین شد، چرا که به شدت از تشکیلات فراماسونری متنفر بود و برخی از شاگردان دارالفنون به واسطه ملکم‌خان وارد این تشکیلات سری شده‌بودند. با این همه شاه که نگران نوع نگرش اروپاییان به ایران بود و از آنجایی که بستن دارالفنون را نشانه عقب‌ماندگی تلقی می‌کرد، از بستن آن صرف‌نظر کرد. یکی دیگر ار عوامل مخالفت با دارالفنون رواج آموزش پزشکی اروپایی بود. طرفداران نظام پزشکی سنتی، تشکیلات جدید را خطری جدی برای موقعیت شغلی خود احساس می‌کردند. در کلاس‌های طب تا مدت‌ها فقط به تدریس نظری بسنده می‌شد و، از ترس تکفیر، تشریح میسر نبود. اما در ۱۲۳۲ که یکی از بیگانگان به طرز مشکوکی درگذشت به درخواست بازماندگان، یاکوب ادوارد پولاک برای کشف علت مرگ او را با حضور شاگردان کالبدشکافی کرد. سال‌ها بعد یک معلم زبان فرانسه به نام بارنه‌یود پیش از مرگ، جسد خود را به مدرسه فروخت تا با مرگ وی شاگردان به تشریح بدن او بپردازند. برخی مخالفت‌ها نیز ناشی از آن بود که فارغ‌التحصیلان دارالفنون را طرفدار فرهنگ غرب تلقی می‌کردند. به ویژه دانش‌آموختگانی که به ادامهٔ تحصیل در غرب پرداخته بودند. برخی از آن‌ها با رفتارهای خود به این ذهنیت منفی کمک می‌کردند. هشت سال پس از افتتاح دارالفنون به علت ورود تعدادی از فارغ التحصیلان آن به تشکیلات فراماسونری یا فراموشخانه میرزا ملکم خان، بی‌مهری و کم توجهی ناصرالدین شاه به این مدرسه آغاز شد. ناصرالدین شاه قاجار در دهه آخر حکومتش و بیش از گذشته پافشاری فراوان داشت که مسئولان دارالفنون، چه دیوانی و چه فرهنگی از طریق هزینه بالای شهریه و دستچین نمودن دانش آموزان، از ورود فرزندان رعیت‌ها به دارالفنون جلوگیری کنند.